本期AVT小編將圍繞mRNA疫苗，從遞送、給藥、專利三個方面分享mRNA疫苗相關(guān)資訊，那么脂質(zhì)體遞送有何優(yōu)勢？感興趣的小伙伴快來了解下！

 1990 年，Woiff 等首次證實(shí)，體外合成的 mRNA 經(jīng)肌肉注射至小鼠體內(nèi)后有活性蛋白產(chǎn)生。這就是 mRNA 疫苗的雛形。

 但mRNA自身穩(wěn)定性差、易被體內(nèi)的核酸酶降解是制約其發(fā)展的瓶頸。因此，mRNA 疫苗需要有合適的遞送載體將其遞送至體內(nèi)，才能有更好的免疫效果，開發(fā)高效無毒的遞送系統(tǒng)是 mRNA 疫苗成功的關(guān)鍵。

 生輝此前已經(jīng)總結(jié)了上述幾類 RNA 藥物的要點(diǎn)（點(diǎn)擊查看《瓶頸》）。本文將著重分析 mRNA 疫苗的遞送究竟有那幾道難題要解答？

 第一題：遞送載體

 相比于 DNA 疫苗，mRNA 疫苗無需進(jìn)入細(xì)胞核，無整合到基因組的風(fēng)險，相對更安全。mRNA 疫苗既可作為預(yù)防性疫苗預(yù)防流感等感染性疾病，也可作為治療性疫苗治療如癌癥等重大疾病。

 目前 mRNA 疫苗主要包括非復(fù)制型 mRNA 和病毒衍生的自我擴(kuò)增型 mRNA(self-amplifying mRNA， SAM，圖 1)。

 圖丨非復(fù)制型 mRNA(A)和病毒衍生的自我擴(kuò)增型 mRNA(SAM)(B)結(jié)構(gòu)組成（來源：J Int Pharm Res，Vol.46，No.5，May，2019 ）

 非復(fù)制型 mRNA 是利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合，與真核生物 mRNA 分子結(jié)構(gòu)一致，主要由 5'非翻譯區(qū)（untranslated region, UTR）、開放閱讀框（open reading frame, ORF）、3'非翻譯區(qū)、5'帽子結(jié)構(gòu)（Cap）和 100-250bp 多聚腺苷酸尾巴（Poly (A）)組成。5'-UTR 和 3'-UTR 中的調(diào)節(jié)元件可穩(wěn)定 mRNA 并增加抗原蛋白質(zhì)翻譯。ORF 是含有編碼抗原的核酸序列，Cap 能使 mRNA 沿著正確的方向進(jìn)行翻譯。Poly (A）能增加 mRNA 的穩(wěn)定性和抗原蛋白的表達(dá)，對 mRNA 的翻譯和穩(wěn)定性具有重要作用，可經(jīng) Poly (A）聚合酶添加到 mRNA 上。mRNA 的合成一般是以含靶蛋白 ORF 的質(zhì)粒為模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成，最后再加上 5'Cap 和 3'端 Poly (A）。體外合成的 mRNA 進(jìn)入細(xì)胞后，在核糖體上進(jìn)行翻譯，形成功能性蛋白。

 病毒衍生的自我擴(kuò)增型mRNA（SAM）是將編碼抗原的核酸序列直接插入單鏈 RNA 病毒中(如塞姆利基森林病毒、黃熱病毒等)，通常相對分子質(zhì)量比較大，能表達(dá)大量的抗原。目前使用的 SAM 疫苗大多基于甲病毒基因組，其中編碼 mRNA 復(fù)制機(jī)制的基因是完整的，只是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因被目的基因替換，利用 DNA 模板經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)即易得到。

 mRNA疫苗遞送載體主要包括病毒載體和非病毒載體。以慢病毒、腺相關(guān)病毒、仙臺病毒等載體為主的病毒載體雖能進(jìn)行核酸遞送，但可能會因載體引起的免疫反應(yīng)而受到限制，影響其應(yīng)用。

 而非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)、無機(jī)納米粒子、陽離子細(xì)胞穿膜肽等。其中，脂質(zhì)體遞送 mRNA 具有獨(dú)特優(yōu)勢: 1）脂質(zhì)體為球形囊泡，可將 mRNA 包裹在內(nèi)，抵御核酸酶的作用；2）脂質(zhì)體類似于細(xì)胞膜，易與受體細(xì)胞融合，轉(zhuǎn)染效率高；3）脂質(zhì)體可遞送不同大小片段的 mRNA；4）脂質(zhì)體作為遞送載體不受宿主限制。截至目前，脂質(zhì)載體已成為遞送 mRNA 最為有效的非病毒載體。常用的遞送 mRNA 的脂質(zhì)體材料見表 1。

 （來源：J Int Pharm Res，Vol.46，No.5，May，2019）

 目前，用于遞送mRNA的非病毒載體中以脂質(zhì)體應(yīng)用的最為廣泛，主要包陽離子括脂質(zhì)體復(fù)合物 (lipoplex，LP)、脂質(zhì)體聚合物(lipopolyplex，LPR)、脂質(zhì)體納米粒(lipid nanoparticle，LNP)、陽離子納米乳(cationic nanoemulsion，CNE)等。

 最早使用的脂質(zhì)體遞送材料是陽離子脂質(zhì)體。帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的 mRNA 通過經(jīng)靜電作用聚集形成多層囊狀復(fù)合物，稱為脂質(zhì)體復(fù)合物 (lipoplex，LP)，復(fù)合物中包封的 mRNA 不易被 RNase 降解，能被成功遞送至細(xì)胞翻譯成功能性蛋白。2-二油酰基羥丙基 - 3-N，N，N - 三甲銨氯(DOTAP) 和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) 是已被證實(shí)有效的遞送載體。

 陽離子聚合物具有濃縮mRNA的作用，mRNA與聚合物濃縮后被陽離子脂質(zhì)體包裹在囊狀空腔中則形成脂質(zhì)體聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR 最早用于DNA轉(zhuǎn)染，后來也用于siRNA和mRNA轉(zhuǎn)染。

 脂質(zhì)體納米粒LNP一般由被脂質(zhì)雙層殼包圍的水性核心組成，脂質(zhì)雙層殼由不同的脂質(zhì)組成，每種脂質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能。LNP 是目前主流的遞送載體之一，然而，早期的陽離子 LNP 在體內(nèi)的應(yīng)用仍然受到很大限制，比如容易被巨噬細(xì)胞清除和產(chǎn)生有害的活性氧簇 ROS 等。

 為了解決這些問題，“可離子化”LNP 的概念被提出。雖然大大促進(jìn)了核酸藥物的發(fā)展，但仍然不盡人意。納米顆粒的體積比較大，一般需要靜脈注射，只能有效進(jìn)入肝臟，脾臟和腫瘤等空隙較大的組織。另外，LNP 的過敏反應(yīng)也比較嚴(yán)重，在注射之前需要使用抗組胺和激素藥物控制。這些缺點(diǎn)讓 LNP 藥物只適用于罕見病和癌癥等嚴(yán)重疾病。

 Brito 等使用陽離子納米乳 (cationic nanoemulsion，CNE) 遞送不同種類的 SAM 疫苗，該 CNE 配方是基于諾華專利佐劑 MF59。相比于 LNP，CNE 已用于臨床試驗，具有更重要的臨床意義。

 即使許多藥物（如生化藥物抗癌抗真菌藥物、基因藥物、麻醉劑）通過脂質(zhì)體進(jìn)行遞送，并取得了成功，但是由于脂質(zhì)體本身存在一些缺點(diǎn)，如易氧化降解、制備重現(xiàn)率差等，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不易實(shí)現(xiàn)等問題都有待解決，同時由于傳統(tǒng)脂質(zhì)納米粒的開發(fā)過程進(jìn)展緩慢，目前開發(fā)出來的有效遞送載體非常有限。

 而遞送載體只是待破解的難題之一，與其正相關(guān)的給藥機(jī)制同樣不明朗。

 第二題：給藥方式

 mRNA 疫苗的給藥方式非常重要，會決定mRNA疫苗在體內(nèi)的代謝，及目的抗原蛋白翻譯的效率。例如，如果直接靜脈注射未經(jīng)任何處理的裸露 mRNA，就會被血液中的核酸酶迅速降解。

 mRNA 疫苗的給藥分為系統(tǒng)給藥或者局部給藥，根據(jù)抗原蛋白需要表達(dá)的位置來決定（下圖所示為系統(tǒng)給藥和局部給藥）。如果是預(yù)防性疫苗，為了引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，通常用皮下和肌肉注射的局部給藥，如果是治療性 mRNA 疫苗通常通過腹腔或者靜脈注射系統(tǒng)給藥。

 圖丨系統(tǒng)給藥和局部給藥（來源：Biomaterials for mRNA delivery）

 同時，對于脂質(zhì)體遞送 mRNA 來說，不同的給藥途徑對誘導(dǎo)蛋白表達(dá)、給藥頻率及副作用強(qiáng)度具有重要影響。如 LNP 遞送可通過改變給藥途徑來改變 mRNA 體內(nèi)表達(dá)量和持續(xù)時間，其中，肌注和皮內(nèi)注射顯示出比靜脈注射更持久的蛋白表達(dá)。

 研究表明，脂質(zhì)體主要的給藥方式有以下 5 種類。

 1）靜脈注射。一種全身給藥的方式，藥物經(jīng)血液流經(jīng)全身，藥效發(fā)揮迅速，也是脂質(zhì)體遞送 mRNA 常用的給藥方式。脂質(zhì)體在靜脈注射后首先被富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的組織 (肝、脾) 攝取，而后被單核巨噬細(xì)胞吞噬，少量被肺、骨髓攝取。因進(jìn)入血液中的脂質(zhì)體大小及電荷不同，其在血液中清除速率也不一樣，大的脂質(zhì)體清除速率要比小的快。靜脈注射不可避免的缺點(diǎn)是脂質(zhì)體中若殘留有制備時產(chǎn)生的毒性溶劑，會對機(jī)體產(chǎn)生比其他給藥方式更大的副作用。

 2）皮下注射。是常規(guī)疫苗接種第二種最常用的給藥方式。皮下注射是將 mRNA 遞送至皮膚和骨骼肌之間，這種給藥方式可直接轉(zhuǎn)染 mRNA 至淋巴結(jié)中的 DC，但皮下注射對劑量有一定的限制，若給藥劑量過多需要分點(diǎn)注入，操作難度大。

 3）肌肉注射。將 mRNA 遞送至肌肉組織內(nèi)。這種給藥方式的優(yōu)點(diǎn)是容易實(shí)現(xiàn)大劑量給藥，但對粒徑和電荷具有特殊的要求，粒徑和電荷較大則會減少遞送，影響藥效。

 4）皮內(nèi)注射?？芍苯訉⒅|(zhì)體遞送至表皮和真皮之間。表皮和真皮之間具有大量免疫細(xì)胞(朗格漢細(xì)胞、DC 亞型)，皮內(nèi)注射給藥可有效誘導(dǎo) Th1（輔助性 T 細(xì)胞 1） 型免疫應(yīng)答。但其與皮下注射缺點(diǎn)相同，均無法實(shí)現(xiàn)大劑量給藥，需要分點(diǎn)注射或多次給藥才能達(dá)到所需治療劑量。

 5）DC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。mRNA 疫苗另外一種非常重要的給藥方式是通過 DC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染進(jìn)行給藥，分為體內(nèi)和體外兩種 DC 細(xì)胞介導(dǎo)的方式。DC 細(xì)胞是人體重要的抗原遞呈細(xì)胞，其攝取抗原后可以誘導(dǎo)隨后的免疫反應(yīng)。在體外分離得到人體未成熟的 DC 細(xì)胞后，可以通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染 mRNA，再把轉(zhuǎn)染后的 DC 細(xì)胞過繼入人體，產(chǎn)生被動免疫。

 但是通過體外 DC 轉(zhuǎn)染的方式遞送 mRNA 疫苗對技術(shù)的要求非常高，需要較長的體外培養(yǎng)時間，而且首先需要獲取人體的 DC 細(xì)胞，在普通條件下難以實(shí)現(xiàn)。另外一個通過 DC 細(xì)胞給藥的方式是淋巴內(nèi)給藥，mRNA 被直接注射到淋巴內(nèi)，這樣 mRNA 就可以被淋巴內(nèi)固有 DC 細(xì)胞獲取，但是這種給藥方式通常需要手術(shù)輔助，導(dǎo)致給藥非常復(fù)雜且?guī)Я舜罅康娘L(fēng)險。

 綜上所述，以上 5 種給藥方式雖為常用的疫苗給藥方式，但具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，使用哪一種給藥方式要根據(jù)具體情況分析。

 現(xiàn)階段，受制于遞送效率，mRNA 分子只有極少（0.01%）能成功進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并表達(dá)蛋白，因此大劑量給藥仍是常態(tài)，將會帶來較大的副作用。只有選擇合適的給藥方式，脂質(zhì)體才能更好遞送 mRNA，使其以更小的劑量、更少的副作用，激發(fā)起更大的免疫效果。

 第三題：專利護(hù)城河

 全球范圍內(nèi)，尚無基于 mRNA 技術(shù)平臺研發(fā)的治療或預(yù)防性藥物、疫苗獲批上市。國外有“mRNA 疫苗研發(fā)三巨頭”：Moderna、CureVac、BioNTech，均采用脂質(zhì)納米技術(shù)遞送（LNP），這也是目前在核酸藥物領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的遞送技術(shù)類型。

 其中，Moderna 專注于 mRNA 藥物的開發(fā)。這家公司 2010 創(chuàng)立；2011 年正式運(yùn)行；2018 年上市，創(chuàng)造了美股史上最大生物科技公司 IPO 記錄。但技術(shù)、專利本身存在的問題讓 Moderna 一直處于風(fēng)口浪尖。

 最核心的爭議是 Moderna 的核心技術(shù)及其專利保護(hù)能力。

 首先是mRNA藥物最為關(guān)鍵的遞送問題。Moderna 最初使用的脂質(zhì)體技術(shù)會激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和肝毒性 (特別是在重復(fù)注射時)，直接導(dǎo)致了早期產(chǎn)品線的失敗。

 Moderna 宣稱在后續(xù)產(chǎn)品使用了自己開發(fā)的新型脂質(zhì)體遞送技術(shù)，然而，首個質(zhì)疑的聲音來自 Arbutus——Arbutus 懷疑 Moderna 至少在兩個最領(lǐng)先的產(chǎn)品中非法使用了 Arbutus 的 LNP 遞送技術(shù)，隨后 Arbutus 提出了一場關(guān)乎 Moderna 關(guān)鍵產(chǎn)品命運(yùn)的法律訴訟。

 Moderna 先后 4 次從獲得 Arbutus 授權(quán)的 Acuitas 取得 LNP 技術(shù)的使用資格，然而，根據(jù)當(dāng)初 Arbutus 與 Acuitas 的授權(quán)協(xié)議，Acuitas 只在“antisense”和“gene therapy” 兩個領(lǐng)域擁有 LNP 技術(shù)的使用和二次授權(quán)權(quán)利，同時還限定了在二次授權(quán)時，所授權(quán)的產(chǎn)品必須由 Acuitas 開發(fā)、并已在動物模型中完成初步驗證。因此，Arbutus 指控 Moderna 與 Acuitas 的授權(quán)協(xié)議涉嫌重大違約：Acuitas 將所有基于 LNP 技術(shù)的專利和技術(shù)要點(diǎn)都授權(quán)給 Moderna，而不是當(dāng)初限定的兩個治療領(lǐng)域，也不是由 Acuitas 開發(fā)并完成臨床前驗證的產(chǎn)品。

 2018 年 2 月，裁定結(jié)果剝奪了 Acuitas 繼續(xù)使用和二次授權(quán) LNP 技術(shù)的權(quán)益，Moderna 可以慶幸的是雖然無法在其他領(lǐng)域使用 LNP 技術(shù)，之前獲得授權(quán)的 4 個產(chǎn)品仍然保留了使用權(quán)，Moderna 將向 Arbutus 支付費(fèi)用。

 Moderna 申明現(xiàn)在使用的是公司內(nèi)部研發(fā)的新型脂質(zhì)體遞送技術(shù)，但 Arbutus 表示根據(jù) Moderna 所發(fā)表的文獻(xiàn)、報告和專利分析提出，Moderna 很難在不依靠 Arbutus 專利的情況下，開發(fā)出有效的脂質(zhì)體遞送技術(shù)。因此，不能排除 Moderna 將繼續(xù)陷入專利戰(zhàn)的可能。

 Moderna 的核苷修飾技術(shù)則是另一專利糾紛的焦點(diǎn)。

 體外合成的mRNA具有較高的免疫原性，可能會誘發(fā)大量炎癥反應(yīng)。人體對 mRNA 的免疫反應(yīng)主要和尿苷 (部分由尿嘧啶組成)有關(guān)，而利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能夠減少免疫系統(tǒng)對 mRNA 的識別，這種修飾策略最初由賓夕法尼亞大學(xué)發(fā)明并最終將專利賣給了 Cellscript。

 Moderna 在成立之初的重點(diǎn)之一，就是找到能夠繞開假尿嘧啶專利的新的修飾方法，并且似乎是成功了——Moderna 找到了 1 - 甲基假尿嘧啶，并終于在 2014 年獲得了多項專利授權(quán)。但令人玩味的是，2017 年 6 月，Moderna 仍然選擇了從 Cellscipt 購買假尿嘧啶核苷修飾方法的專利使用權(quán)，并為此先期支付了 7500 萬美元的專利使用費(fèi)，以及后續(xù)每個產(chǎn)品 2600 萬美元的里程碑付款和個位數(shù)的銷售提成。Moderna 現(xiàn)在的產(chǎn)品線是否有專利護(hù)城河保衛(wèi)，令人生疑。

 生輝觀點(diǎn)

 mRNA 疫苗生產(chǎn)工藝簡單、合成快速、成本較低，本身具有激活免疫反應(yīng)的佐劑作用。Moderna、CureVac 等公司融資金額已經(jīng)很高，但最快的臨床試驗僅進(jìn)展到 II 期，由于動物環(huán)境和人體環(huán)境差異較大，遞送系統(tǒng)在人體內(nèi)效率、mRNA 穩(wěn)定性等都需要大量臨床實(shí)驗予以進(jìn)一步驗證。

 國內(nèi)方面，依托于重大高校科研專利，斯微 (上海) 生物科技有限公司﹑艾博生物醫(yī)藥（杭州）有限公司﹑上海藍(lán)鵲生物醫(yī)藥有限公司在新冠疫苗的研發(fā)方面取得重要進(jìn)展，盡管尚未進(jìn)入臨床試驗階段，安全性和有效性有待確認(rèn)。

 當(dāng)前，mRNA 疫苗的研究還集中于增強(qiáng)其穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)其免疫原性、發(fā)展新的傳遞技術(shù)、拓展更廣的疾病治療范圍等方面，開發(fā)出成熟的藥物仍有待時日。

 參考

 https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/rna.22269

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=e28268d4b63ddb3b22270ea1763b2892&site=xueshu_se

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=e28268d4b63ddb3b22270ea1763b2892&site=xueshu_se

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=a985458fdb64a87549d6f241ee836675

 本文內(nèi)容分享自知乎文章《mRNA疫苗的三道必答難題：遞送、給藥、專利》作者:DeepTech深科技