不同生產(chǎn)工藝的玻尿酸差別

一、 玻尿酸總述

 

玻尿酸（HA）是一種由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的線性多糖結(jié)構(gòu)分子，這種結(jié)構(gòu)來(lái)源于HA的生物合成途徑，HA在生物體內(nèi)合成過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多種糖基轉(zhuǎn)移酶和有關(guān)修飾酶的作用，形成有特定順序的重復(fù)單位的線形分子。從其結(jié)構(gòu)上可以看出，由于直鏈軸上的基團(tuán)之間的氫鍵作用，HA分子空間結(jié)構(gòu)為二折體或三折體的螺旋結(jié)構(gòu)，玻尿酸的二折體或三折體螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折繞，形成特有的三級(jí)結(jié)構(gòu)，賦予其彈性。同時(shí)葡萄糖醛酸殘基上的羧基使它一具有特殊的粘性，較多的親水基團(tuán)和疏水區(qū)域使其有優(yōu)異的保濕功能。因此玻尿酸作為構(gòu)成人體細(xì)胞間質(zhì)、眼玻璃體、關(guān)節(jié)滑液等結(jié)締組織的主要成分，在體內(nèi)發(fā)揮保水、維持細(xì)胞外空間、調(diào)節(jié)滲透壓、潤(rùn)滑、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)的重要生理功能；同時(shí)玻尿酸能使皮膚、血管等保持柔韌性和彈性，是生命體不可缺少的物質(zhì)之一。

目前關(guān)于玻尿酸的生產(chǎn)工藝，在工業(yè)生產(chǎn)上主要有組織提取法和微生物發(fā)酵法兩種工藝，下面我們就這兩種工藝基本情況的介紹以及不同玻尿酸獲取工藝的特點(diǎn)，做一個(gè)詳細(xì)的介紹。

二、 動(dòng)物組織提取工藝生產(chǎn)玻尿酸

 

2.1 工藝原理

玻尿酸是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和細(xì)胞間質(zhì)（ICM）的主要成分，在動(dòng)物的各種組織中廣泛存在，如動(dòng)物的結(jié)締組織、臍帶、皮膚、血清、雞冠、關(guān)節(jié)滑液、眼玻璃體等部分都存在不同含量和不同平均分子量的玻尿酸，其中在臍帶，關(guān)節(jié)液、玻璃體和雞冠中的透明質(zhì)酸含量是最高的。

玻尿酸的組織提取法工藝就是利用高HA含量的動(dòng)物組織作為提取原料，在蛋白酶（胰酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶）的酶解作用下，使HA與蛋白質(zhì)分離從而將HA提取出來(lái)，隨后經(jīng)過(guò)除雜、沉淀和分離等工藝后，即可得到HA粗產(chǎn)品，再經(jīng)過(guò)反復(fù)純化處理即可得到精制HA原料。

2.2 工藝過(guò)程

透明質(zhì)酸的組織提取法主要是從雞冠、動(dòng)物臍帶、動(dòng)物眼球等組織中提取，在工業(yè)化生產(chǎn)中，一般采用酶解法進(jìn)行HA的制備。我們以雞冠為原料，采用酶解組

織提取法工藝為例，詳細(xì)介紹動(dòng)物組織提取工藝生產(chǎn)玻尿酸的工藝過(guò)程。

圖1：雞冠提取玻尿酸生產(chǎn)工藝路線

2.2.1 雞冠原料處理

雞冠富含HA，工業(yè)上使用雞冠原料提取HA時(shí)，玻尿酸的收率一般可達(dá)數(shù)g/kg。在使用雞冠提取玻尿酸時(shí)，首先需要通過(guò)凍融、丙酮浸泡等方式對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行預(yù)處理，分離得到HA含量較高的動(dòng)物組織。然后用絞肉機(jī)或合適工具絞碎物料，最后經(jīng)研磨等勻漿化，制成勻漿。為便于勻漿化，解凍脫血水后可用80~ 90 ℃水處理0.5~ 1 h，使物料呈“半熟”狀態(tài)，這使蛋自質(zhì)變性，組織所含酶失活，對(duì)后續(xù)蛋白質(zhì)酶解有利。

2.2.2 酶解蛋白提取或無(wú)機(jī)鹽/堿萃取HA

通過(guò)胰酶和堿性蛋白酶對(duì)勻漿進(jìn)行酶解，蛋白質(zhì)被酶解，蛋白質(zhì)與HA的絡(luò)合被解除，從而使HA與蛋白分離開(kāi)，此時(shí)HA即可溶入水中。酶解并不是要求將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，而是盡可能完全地使絡(luò)合物離解出HA來(lái)。可使用各種蛋白水解酶，如胃酶、胰酶及許多微生物酶，根據(jù)酶活性和特性的不同，加入5~ 50萬(wàn)U/kg組織的酶量，將溫度和pH值調(diào)到酶具有最高活性的值，保溫?cái)?shù)小時(shí)至一天，酶可一次加入，也可分批加入。

無(wú)機(jī)鹽或無(wú)機(jī)堿可以使HA與蛋白質(zhì)等的絡(luò)合狀態(tài)解除，因此采用無(wú)機(jī)鹽或無(wú)機(jī)堿也可以從雞冠中萃取出HA，工業(yè)上常用0.1~ 0.5M的氯化鈉溶液對(duì)勻漿進(jìn)行處理，也可用0.1M的氫氧化鈉溶液萃取雞冠、臍帶中的HA，需要注意的是，過(guò)分劇烈的化學(xué)條件可能會(huì)造成玻尿酸的降解和變性（乙酰氨基水解），因此在使用無(wú)機(jī)鹽或無(wú)機(jī)堿時(shí)，需要控制好提取條件。

2.2.3 過(guò)濾分離除雜

萃取或酶解所得混合物經(jīng)壓濾或離心分出HA溶液，抽濾會(huì)形成大量泡沫，操作有困難。制高純產(chǎn)品時(shí)，濾液須再用氯仿脫色，用丙酮脫脂，用蛋白酶分解殘存蛋白質(zhì)，或者通過(guò)三氯乙酸沉淀等方法去除雜蛋白。

2.2.4 沉降HA

過(guò)濾得到的玻尿酸溶液濃度很低，用濃縮法不能回收HA，只能用沉降法。目前有乙醇法和十六烷基鹽酸吡啶法兩種。其中，乙醇法中常用1~3倍體積乙醇沉淀，HA在由此形成的醇水介質(zhì)中難溶，沉降很徹底。N -十六烷基鹽酸吡啶水溶液的濃度為5%，用量視濾液濃度而定，可為濾液的5%~ 10%（以100%計(jì)）。它能與透明質(zhì)酸反應(yīng)，形成不溶于水的透明質(zhì)酸-N -十六烷基吡啶鹽而沉淀。

2.2.5 精制HA

沉降的HA含有蛋白質(zhì)、其它粘多糖等雜質(zhì)，常需凈化精制。精制包括再溶解、再沉降。精制可以提高純度，但會(huì)造成HA原料的損失、降低收率。如需更高純度，要重復(fù)進(jìn)行再溶解和再沉降。最多可反復(fù)5次，這時(shí)產(chǎn)品純度很高，但收率下降，甚至不足1 g/kg組織。

再溶解使用兩種溶劑，0.1N的氯化鈉溶液或30%~ 40%乙醇溶液為溶劑的0.5 N的氯化鈉溶液。濾除不溶物后用95%乙醇進(jìn)行再沉降。然后用乙醇洗滌，以除去吸附水，最后采用真空干燥對(duì)HA原料進(jìn)行烘干。

純度較高的HA要求蛋白質(zhì)含量小于0.1%，高純產(chǎn)品，特別是植入類(lèi)玻尿酸產(chǎn)品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)十分苛刻，必須達(dá)到較低的雜蛋白，無(wú)熱源，較高分子量等，按此要求，最終得到透明質(zhì)酸量約為雞冠重量的0.1%，自然注射級(jí)HA的價(jià)格也就更高。

2.3 工藝特點(diǎn)

透明質(zhì)酸的組織提取法過(guò)程包括脫水、磨碎、浸泡、提取、除雜、沉淀和分離。這種方法的特點(diǎn)是工藝流程簡(jiǎn)單，獲得的透明質(zhì)酸分子量較大，粘度高，保濕性能好，適用于原料來(lái)源分散的小規(guī)模生產(chǎn)。但由于原料有限，且原料中HA 的含量低，同時(shí)HA 又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，致使其收率低、提純難、成本過(guò)高、產(chǎn)品質(zhì)量差，且難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。另外用生物原料提取的HA常含較多的蛋白質(zhì)而純度不高。在提取過(guò)程中使用三氯乙酸變性沉淀蛋白質(zhì)還會(huì)造成分子量的下降。用這種方法HA時(shí)，分子量、產(chǎn)率和純度之間存在矛盾。除此之外，動(dòng)物源制品容易成為病毒傳播的載體，會(huì)有引起交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。

三、 微生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)玻尿酸

3.1 發(fā)酵工藝原理

 

圖2：鏈球菌莢膜示意圖

微生物發(fā)酵法主要用的菌種為鏈球菌，玻尿酸的合成主要在鏈球菌體的細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞膜上進(jìn)行，是一個(gè)連續(xù)而又復(fù)雜的過(guò)程，HA的兩個(gè)合成前體是尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖(UDP-N-Glc NAc)和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-Glc A)。在玻尿酸的合成過(guò)程中，HA合成酶交替地將兩種前體物質(zhì)添加到HA分子鏈上，合成速度每分鐘大約100個(gè)糖單位。與此同時(shí)，逐漸增長(zhǎng)的HA鏈會(huì)被送到胞外基質(zhì)中，因此鏈球菌屬的多種細(xì)菌的莢膜都有大量的HA成分，如圖2所示。而微生物發(fā)酵法則就是利用鏈球菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，向胞外分泌以HA為主要成分的莢膜，而后通過(guò)分離純化而制備得到HA。

3.2 發(fā)酵工藝過(guò)程

由于HA 具有特殊的功能及廣泛的用途，規(guī)模化生產(chǎn)HA 十分必要。如果僅依賴(lài)于從動(dòng)物組織中提取，很難滿足市場(chǎng)的需求。而發(fā)酵法生產(chǎn)HA 成本低、產(chǎn)品純度高、易形成規(guī)模化生產(chǎn)，具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用前景，采用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)HA的工藝流程如下：

 

圖3：鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)HA工藝流程

獸疫鏈球菌在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)酵一段時(shí)間，所用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等，氮源主要有蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏等，以及常用的無(wú)機(jī)鹽，如K2HPO4、MgSO4、NaCl等。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液離心去除獸疫鏈球菌的菌體。上清液加入乙醇醇沉后得HA粗提物。之后可以用離子交換劑或者加入氯化十六烷吡啶(CPC)，再經(jīng)過(guò)在氯化鈉溶液中的析出與溶解，除去獸疫鏈球菌代謝生成的蛋白質(zhì)、游離的核酸和其他的菌體雜質(zhì)性產(chǎn)物等。最后經(jīng)過(guò)醇沉、離心和干燥后，可以得到精制HA。

利用微生物發(fā)酵生成HA 的質(zhì)量和數(shù)量主要取決于三個(gè)方面：一是菌種的篩選，二是培養(yǎng)基的選配及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，三是分離提純。發(fā)酵法的關(guān)鍵在于菌種的選擇，可產(chǎn)生HA 的鏈球菌多為A群和C群，A群中主要有釀膿鏈球菌等，由于致病性較強(qiáng)，較少用作菌種進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵；C群致病性較弱，多采用此類(lèi)菌，主要有獸疫鏈球菌、馬鏈球菌和類(lèi)馬鏈球菌等。發(fā)酵生產(chǎn)HA 所用的菌種，一般是將產(chǎn)生HA 的鏈球菌進(jìn)行誘變處理得到的，經(jīng)過(guò)幾步誘變處理，篩選出莢膜大、HA 產(chǎn)率高、無(wú)HA 酶和溶血素的變異菌株。

目前國(guó)內(nèi)HA的發(fā)酵產(chǎn)率為4~5g/L，從發(fā)酵液到最終產(chǎn)品的純化收率為60%~70%。發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高目標(biāo)產(chǎn)量所必需的的一個(gè)步驟。通過(guò)優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件，可以使透明質(zhì)酸的產(chǎn)量得到穩(wěn)定提高。篩選的菌株在以蔗糖或者葡萄

糖為碳源，酵母粉、牛肉浸膏等為氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)過(guò)程中的溫度、溶氧條件、攪拌速度等因素，而且在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸，這將會(huì)抑制透明質(zhì)酸的生成，同時(shí)也會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)。因此在發(fā)酵過(guò)程中，還要抑制乳酸的生成，如此結(jié)合才可以得到富含透明質(zhì)酸的發(fā)酵液。

3.3 發(fā)酵工藝特點(diǎn)

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)規(guī)模不受動(dòng)物原料限制，無(wú)動(dòng)物來(lái)源的致病菌污染，具有低成本、髙產(chǎn)量和高分子量的優(yōu)點(diǎn)，并且發(fā)酵液中HA以游離狀態(tài)存在，易于分離純化和形成規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，逐漸成為透明質(zhì)酸生產(chǎn)的主要發(fā)展方向。而且各種來(lái)源的HA 無(wú)種屬差異，不同動(dòng)物組織提取及不同菌種發(fā)酵生產(chǎn)的HA，在化學(xué)本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)上是一致的，只是相對(duì)分子質(zhì)量有差別。

然而由于發(fā)酵液中含有大量的菌體，這些菌體可以分泌一種可解離HA的透明質(zhì)酸酶，降低HA分子量，從而影響到HA產(chǎn)品的質(zhì)量，所用進(jìn)行下游分離純化時(shí)，必須盡快殺滅和除去發(fā)酵液中的菌體，并使酶失活。同時(shí)發(fā)酵液中的HA含量高、分子量大，所以發(fā)酵液的粘度很高，這就給分離的過(guò)程帶來(lái)許多不便，如不能用離心法除菌體，收率會(huì)因HA的黏附而降低等。最后，由于對(duì)HA產(chǎn)品分子量有十分嚴(yán)格的要求，而HA易因酸、堿或加熱處理而分解；在鐵、銅等金屬離子和抗壞血酸或半胱氨酸等還原劑共存下，經(jīng)氧自由基、X射線、Y射線、紫外線和超聲波作用而降解；它還可被透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶分解。因此，對(duì)HA的提取就要求在分離純化的同時(shí)，嚴(yán)格控制條件，減少HA分子的降解，保證產(chǎn)物的高分子量。

四、動(dòng)物組織提取法和鏈球菌發(fā)酵法生產(chǎn)HA的對(duì)比