2021年4月15日，《cell》第8期184卷上刊出文章“Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling[1]”

摘要： 在細(xì)胞遷移和分化過程中，細(xì)胞的表面受體可以同時結(jié)合不同的配體，然而，對于如何整合這些細(xì)胞外信號的了解卻比較少。當(dāng)Netrin-1（NET1）結(jié)合配體時，Neogenin（NEO1）會充當(dāng)具有吸引力的引導(dǎo)受體，但它也會通過排斥性導(dǎo)向分子（RGM）介導(dǎo)排斥。文章揭示，通過三元聚合物（NEO1-NET1-RGM）復(fù)合物的形成進(jìn)而整合了細(xì)胞外的信號并觸發(fā)了下游信號的相互沉默。作者通過NEO1-NET1-RGM結(jié)構(gòu)揭示了存在于細(xì)胞膜中的“三聚體”超級組裝，并且這個超級組裝形成的三聚體會通過阻斷RGM-NEO1復(fù)合物形成的信號以及NET1誘導(dǎo)下的NEO1胞外聚集，進(jìn)而抑制RGMA介導(dǎo)的生長錐塌陷以及RGMa或NET1-NEO1介導(dǎo)的神經(jīng)元遷移。這些結(jié)果驗證了當(dāng)兩個具有相反功能的配體與單個受體同時結(jié)合時，不會導(dǎo)致競爭性結(jié)合，而是會形成降低其功能的超級復(fù)合物。

 

圖1. “3-3”聚合體的作用示意圖

結(jié)果：為了剖析通過RGM和NET1相互作用控制NEO1信號傳導(dǎo)的分子機制，作者使用了表面等離子體共振（SPR）以及細(xì)胞表面結(jié)合實驗確定了NET1-NEO1相互作用的最小結(jié)合區(qū)域，測試表明，最小復(fù)合物由NEO1的三個靠近膜的FN結(jié)構(gòu)域（NEO1FN456）以及一個缺少了C端的NTR結(jié)構(gòu)域的NET1（NET1NTR）組成，這也與之前的研究結(jié)果一致。

 

圖2 NEO1、NET1、RGMB的示意圖

由于細(xì)胞可以在體內(nèi)以依賴NEO1 的方式同時遇到 RGM 和 NET1，作者探究細(xì)胞表面是否存在穩(wěn)定的三元NEO1-NET1-RGM復(fù)合物，或者NET1和RGM是否會競爭結(jié)合NEO1。為了探究這兩種區(qū)別，作者采用Proximity Ligation Assay（PLA）實驗，將經(jīng)過細(xì)胞表達(dá)并純化的全長的NEO1與NETNTR以及全長的胞外RGMB進(jìn)行相互培養(yǎng)，觀察到遇到PLA現(xiàn)象，并且只有當(dāng)NET1與RGMB非常接近且距離＜40nm時才會產(chǎn)生。當(dāng)RGMB突變?yōu)椴豢涉溄覰ET1時，PLA現(xiàn)象明顯減少。結(jié)果表明，NEO1是連接NET1和RGMB所必需的，并且會在細(xì)胞表面形成三元復(fù)合物。

 

圖3. NEO1-NET1-RGMB三聚體

為了揭示NEO1、NET1以及RGMB如何組裝成三元復(fù)合物，作者收集到復(fù)合物分辨率為3.25A晶體結(jié)構(gòu)，并通過超速離心分析（AUC）和小角度X射線散射（SAXS）分析了“3-3”三聚體的溶液穩(wěn)定性，最終確定了超級復(fù)合體3：3：3NEO1-NET1-RGMB的基本組成。

“3-3”超級復(fù)合體的主體本質(zhì)上是由NEO1和NET1之間的相互作用形成的。NET1是細(xì)長的且剛性的分子，使得與兩個相鄰NEO1分子接觸，以彌合超復(fù)合物。冷凍電鏡結(jié)果顯示，有四個N連接上蔗糖，另外有四個位置通過非共價連接了八硫酸酯鹽（SOS）分子，蔗糖八硫酸酯協(xié)助確認(rèn)三元聚合物超級復(fù)合體比例。NET1和RGMB分子形成非常小的相互作用，同時也未觀察到NET1與溶液中RGMA以及RGMB的相互作用。這也表明了NET1-NEO1相互作用是形成“3-3“超級復(fù)合體的驅(qū)動力。

 

圖4. 三元NEO1-NET1-RGM復(fù)雜聚合物的功能性分析

（C、D、E、F、G詳細(xì)標(biāo)明蔗糖八硫酸酯鹽在復(fù)雜三聚體表面的結(jié)合位置）

之前的研究結(jié)果表明，RGMB對DCC的結(jié)合親和力比NEO1低約1000倍。在該研究中該研究團隊顯示在CNs中敲除DCC對RGMA誘導(dǎo)的生長錐塌陷沒有影響，也沒有影響NET1調(diào)節(jié)這種效應(yīng)的能力。DCC缺失不影響NET1介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞遷移，也不影響RGMA或RGMB抑制這種作用的能力。這支持RGM抑制可能歸因于三元NEO1-NET1-RGM復(fù)合物的觀點。NEO1與DCC一起的不同進(jìn)化可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中對三元NEO1-NET1-RGM復(fù)合物的需求來解釋。

該研究團隊的研究表明，NET1可以沉默RGMA介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長錐塌陷，需要NEO1，RGMA和RGMB抑制NET1對神經(jīng)細(xì)胞遷移的積極作用。NET1介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞遷移在體外以劑量依賴性方式被RGMA抑制。這些數(shù)據(jù)表明NET1和RGMA和RGMB在功能上相互作用，并且它們的同時呈現(xiàn)導(dǎo)致其下游效應(yīng)的相互沉默，這與三元復(fù)合物起到沉默受體信號傳導(dǎo)的作用一致。

該實驗也拓寬了蔗糖八硫酸酯鹽的應(yīng)用范圍，在制備冷凍電鏡樣品或蛋白質(zhì)修飾中均存在一定的應(yīng)用價值。由于其獨特的負(fù)電性，可以在蛋白表面尋找可能的結(jié)合位點，并且通過分子量變化，進(jìn)而確定多聚體蛋白質(zhì)的組成，確定蛋白質(zhì)復(fù)合物的各組分比例，為探索蛋白間的相互作用提供可能。

[1] Robinson RA, Griffiths SC, van de Haar LL, et al. Simultaneous binding of Guidance Cues NET1 and RGM blocks extracellular NEO1 signaling. Cell. 2021;184(8):2103-2120.e31. doi:10.1016/j.cell.2021.02.045