對于凍干和冷凍制劑**，在冷凍濃縮過程中緩沖成分的結晶傾向成為一個重要的考慮因素，在冷凍過程中緩沖成分的選擇性結晶可能導致pH值的變化，從而影響蛋白質的穩定性。磷酸鹽緩沖液是一種被**研究的例子，其中十二水磷酸二鈉（磷酸鹽緩沖液的基本成分）在冷凍過程中降低了冷凍濃縮液的pH值，并可能改變蛋白質的穩定性。

緩沖液的結晶行為和凍結過程中相關的pH值變化取決于幾個因素，包括緩沖液的類型和濃度、初始溶液pH和其他配方成分的濃度。

下圖顯示了不同緩沖液在凍結時的pH值變化，按初始pH值的遞增順序(從左到右)繪制。左圖為緩沖液pH偏移＞1單位，右圖為緩沖液pH偏移≤1單位。填充的圓圈表示每種緩沖溶液在室溫25℃時的初始pH值。箭頭指向凍結過程中pH值變化的方向，箭頭的**表示將溶液凍結至-25℃后的*終pH值。

 

從圖中可以觀察到不同因素對緩沖液凍結過程中pH值變化的影響。

 

（1）初始pH值：檸檬酸鹽緩沖液對初始pH為5.0或6.0的溶液效果良好，但當初始pH為4.0時，pH值會發生~+2個單位的變化（淺橘紅色，左圖**個柱子及右圖兩個同色柱子）。同樣，組氨酸緩沖液在pH為5.5時顯示+2個單位的pH位移，而在pH為6.0和7.0時則沒有（深綠色，左圖第四個柱子及右圖兩個同色柱子）。

 

（2）緩沖液濃度：緩沖液的濃度對pH值變化的幅度和性質都有**的影響。例如，初始pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，濃度為100 mM時，*終凍結后pH值為2.8，濃度為10 mM時，*終凍結后pH值為4.1（左圖*右側兩個柱子）。

 

（3）與其他溶質的相互作用：制劑**中的其他溶質和緩沖液組分的相互作用可能會影響彼此的結晶傾向。了解共溶質對緩沖液結晶的影響是很重要的，因為這將影響冷凍濃縮液的pH，從而影響蛋白質的穩定性。

例如，當含有磷酸鹽緩沖液(10或100 mM)和甘氨酸(0.8% w/v)的溶液被冷凍時，這兩種組分都更易結晶。雖然這并不影響甘氨酸作為凍干賦形劑的功能，但緩沖鹽的明顯結晶導致凍結時pH值發生變化。

 

有趣的是，0.8% w/v濃度甘氨酸的存在增加了10mM和100mM磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化幅度。而在低濃度(0.4% w/v)下，甘氨酸反而會抑制磷酸鹽緩沖液在冷凍時的pH值變化。然而，在如此低的濃度下，甘氨酸可能無法發揮凍干賦形劑的作用。因此，需要明智地選擇配方成分及其濃度，以確保各個組分的功能，從而獲得穩定的凍干制劑**。

 

同樣，磷酸鹽緩沖液也能抑制甘露醇結晶。下圖展示了緩沖液濃度對甘露醇和甘氨酸在*終冷凍產品中結晶情況的影響，溶液中甘露醇和甘氨酸含量為5% w/w。當甘露醇和甘氨酸混合使用時，磷酸鹽緩沖鹽在冷凍溶液中**抑制這兩種溶質的結晶，磷酸鹽緩沖液濃度的增加（50mM~200mM）降低了甘露醇和甘氨酸的結晶度。

甘露醇和甘氨酸的結晶度降低，可以轉化為更高的蛋白酶活性保留。下圖為冷凍干燥后輔料結晶對乳酸脫氫酶（LDH）活性的影響。上半部分為蛋白酶活性與緩沖液濃度的關系（配方中甘露醇和甘氨酸各占5% w/w），可見隨著緩沖液濃度升高，凍干后保留的蛋白酶活性升高。下半部分為*終產品中的結晶甘露醇和甘氨酸餾分。隨著緩沖液濃度升高，凍干產物中甘露醇和甘氨酸的結晶度降低。

一般來說，只有無定形的溶質才能抑制緩沖液的結晶。然而，當共溶質結晶時，也觀察到緩沖結晶。

 

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