《mRNA-LNP疫苗的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性》文獻解讀系列六
文章來源:AVT發(fā)布時間:2021-09-06瀏覽次數(shù):
LNP穩(wěn)定性
除了mRNA 的完整性外,LNP 的穩(wěn)定性對于 mRNA-LNP 疫苗的質(zhì)量也至關(guān)重要。目前的mRNA疫苗沒有披露關(guān)于LNP 穩(wěn)定性測試的數(shù)據(jù),但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制劑保存在2~8°C 之間時具有三年的有效期,同時該產(chǎn)品不能冷凍保存。
Onpattro 的LNP 系統(tǒng)的組成是:可電離的陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、PEG2000-C-DMG(見表 1)(摩爾比 50:10:38.5:1.5),它們在組成上類似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一項siRNA-LNPs 的研究中用類脂質(zhì)306O 13代替DLin-MC3-DMA,樣品水溶液在 2°C 、pH 7 的環(huán)境下下能穩(wěn)定儲存156 天,其粒徑和siRNA包封率沒有明顯變化。Suzuki 等人的補充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 環(huán)境下穩(wěn)定儲存1.5。總之,這些數(shù)據(jù)都表明是mRNA 的不穩(wěn)定,而不是 LNP 的不穩(wěn)定,導(dǎo)致了當(dāng)前mRNA-LNP疫苗的儲存條件嚴苛和保質(zhì)期短。
Fan等人總結(jié)了脂質(zhì)體和 LNP的穩(wěn)定性及其質(zhì)量屬性。LNP 可以承受化學(xué)和物理不穩(wěn)定性,化學(xué)不穩(wěn)定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂質(zhì)的降解。脂質(zhì)氧化可能發(fā)生在不飽和脂肪酸部分(Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在該問題)和膽固醇,氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基團存在雜質(zhì)導(dǎo)致的結(jié)果。除此之外,氧化性雜質(zhì)也可能導(dǎo)致包封的mRNA 氧化。脂質(zhì)例如 DSPC 和可電離的陽離子脂質(zhì)中的羧酸酯鍵容易受溫度和pH依賴性的水解的影響(圖 6)。
LNP 穩(wěn)定性的另一個關(guān)鍵因素是物理穩(wěn)定性,主要有三種類型的物理不穩(wěn)定性:包封的藥物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在儲存和流通過程中容易發(fā)生 LNP 的聚集,所以為了增加穩(wěn)定性,LNP 中通常添加PEG化脂質(zhì),LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。
另一種類型的物理不穩(wěn)定性主要由于mRNA 的泄漏,這主要影響包封產(chǎn)品的穩(wěn)定性。值得注意的是,包封率通常 > 90%,并且尚未報道過在儲存期間出現(xiàn)mRNA泄露(用RiboGreen監(jiān)測)的情況。未包封的mRNA(“裸露的mRNA”)幾乎不會被細胞攝取;而且它會迅速被降解,因此無法用于翻譯。

圖6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂質(zhì)。
由于注射 mRNA-LNP疫苗時的超敏反應(yīng)可能與PEG化脂質(zhì)有關(guān),因此,已經(jīng)研究了防止聚集體形成的替代脂質(zhì)。使用多聚肌氨酸修飾脂質(zhì)能使脂質(zhì)遞送系統(tǒng)更加穩(wěn)定,在防止LNP聚集的同時能夠減少超敏反應(yīng)。但是目前仍然需要更多的實驗來確定這種 PEG化脂質(zhì)替代品是否能真正的提高 mRNA 的穩(wěn)定性(例如不含過氧化物,注:目前使用的PEG脂質(zhì)由于工藝原因,會有一定的過氧化物雜質(zhì),這會引起LNP中其他含有不飽和鍵的脂質(zhì)和mRNA的氧化降解)。
分析 LNP 穩(wěn)定性
Fan 等人在前面提到的文章中對監(jiān)測 LNP 穩(wěn)定性的分析方法進行了專業(yè)評估。我們推薦感興趣的讀者可以查看相關(guān)文獻。
mRNA-LNP中哪個成分更不穩(wěn)定?
迄今為止,已有幾項研究考察了在儲存期間穩(wěn)定 mRNA 和穩(wěn)定 LNP 的方法。然而,兩者之中哪一個才是mRNA-LNP穩(wěn)定性的瓶頸?當(dāng)mRNA-LNP 制劑未冷凍時,是mRNA 降解?還是 LNP 降解導(dǎo)致穩(wěn)定性問題?還是 mRNA 與 LNP 的組合?
與mRNA-LNP 系統(tǒng)相比,包封化學(xué)修飾且高度穩(wěn)定的siRNA 分子(例如 Onpattro)的LNP系統(tǒng)具有更長的有效期。這表明當(dāng)前的穩(wěn)定性瓶頸不是 LNP,而是 mRNA。
迄今為止,公開資料還沒有披露關(guān)于 mRNA-LNP 制劑中 mRNA 和 LNP 完整性的研究報告。在研究存儲效果的少數(shù)研究中,例如 Zhang等人的研究,并沒有考察長期儲存的穩(wěn)定性。因此,我們將首先研究裸露的mRNA的長期穩(wěn)定性,但需要注意的是,這可能與包封在 LNP中的 mRNA 的穩(wěn)定性有所不同(見下文)。
在Pascolo等人的綜述中,裸露的mRNA的水溶液在無RNase的情況下只能在4°C下儲存幾天。這似乎符合目前對 mRNA 不穩(wěn)定性的看法。目前關(guān)于裸露的mRNA長期穩(wěn)定性的研究表明,mRNA 需要冷凍或干燥才能保持更長時間的穩(wěn)定。
Roesler等人2009年的研究表明,編碼熒光素酶的mRNA 在無RNA酶存在的條件下,分別以液體或凍干形式在室溫下儲存,表達效率分別在第8天和第16天開始出現(xiàn)降低,凍干輔料和凍干工藝方面未經(jīng)優(yōu)化(見圖 7)。同時本研究無法得出關(guān)于2-8℃溫度下長期儲存穩(wěn)定性的結(jié)論,因為穩(wěn)定性研究只考察了32 天。
Wayment-Steele等人經(jīng)過基于理論降解速率計算,預(yù)測 長度為4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的條件下,存儲的半衰期為 941 天。他們注意到較長的mRNA序列,例如SAM,更容易發(fā)生水解。由于這是jin基于水解降解動力學(xué)的理論計算結(jié)果,可能會低估 了mRNA的實際降解速率,例如,當(dāng)存在痕量RNase時,必須對 mRNA 的穩(wěn)定性進行更多研究才能知道m(xù)RNA實際存儲的穩(wěn)定性情況。
圖7 通過轉(zhuǎn)染BHK-21細胞中熒光素酶表達效率分析mRNA在水中的穩(wěn)定性
這些研究表明,在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 穩(wěn)定。然而,應(yīng)該重申的是,這兩種成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果可能與LNP包封mRNA 的情況不同。如前幾節(jié)所述,mRNA 與可電離的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和水一起位于 LNP 核內(nèi)部(參見圖 4)。這意味著 mRNA 處于水性環(huán)境中,因此容易發(fā)生水解,其水解的機制可能與溶液中 mRNA水解 的機制相似。然而,另一方面,LNP 內(nèi)的 mRNA 可能通過疏水、氫鍵和/或靜電相互作用被可電離的脂質(zhì)包裹。在這種情況下,mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更穩(wěn)定。在沒有進一步研究的情況下,只能得出結(jié)論,mRNA 的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了儲存條件苛刻。
儲存條件不同的原因
當(dāng)前 mRNA 疫苗的另一個有趣方面是,不同廠家疫苗報告的儲存溫度和相應(yīng)的“有效期”差異很大:從 -80°C 到 2-8°C,從幾天到幾個月。是否因為mRNA 疫苗處的不同導(dǎo)致這種儲存條件的差異?又或者,儲存條件的差異是否與熱穩(wěn)定性測試結(jié)果相關(guān)或更可靠的方法有關(guān)?這些信息很重要,因為深入了解對穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響的因素可能是未來設(shè)計熱穩(wěn)定mRNA 疫苗的關(guān)鍵突破點。
Acuitas Therapeutics的首席執(zhí)行官Tom Madden 曾經(jīng)在采訪中表示,Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的穩(wěn)定性。后者是否有可能使用更保守的方法來確保穩(wěn)定性?盡管如此,目前必須在 -60 至 -80 °C 之間儲存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的溫度和冷藏條件下進行了穩(wěn)定性考察,正如CureVac 科學(xué)家所做的那樣。
此外,穩(wěn)定性測試中的分析技術(shù)在靈敏度上可能不同,驗收標(biāo)準(zhǔn)也可能不同。疫苗穩(wěn)定性研究報告的發(fā)布可能對這些疑問作出回答,對此進行比較研究會是很有趣的工作。
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