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《mRNA-LNP疫苗的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性》文獻解讀系列六

文章來源:AVT發(fā)布時間:2021-09-06瀏覽次數(shù):

LNP穩(wěn)定性


除了mRNA 的完整性外,LNP 的穩(wěn)定性對于 mRNA-LNP 疫苗的質(zhì)量也至關(guān)重要。目前的mRNA疫苗沒有披露關(guān)于LNP 穩(wěn)定性測試的數(shù)據(jù),但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制劑保存在2~8°C 之間時具有三年的有效期,同時該產(chǎn)品不能冷凍保存。


Onpattro 的LNP 系統(tǒng)的組成是:可電離的陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、PEG2000-C-DMG(見表 1)(摩爾比 50:10:38.5:1.5),它們在組成上類似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一項siRNA-LNPs 的研究中用類脂質(zhì)306O 13代替DLin-MC3-DMA,樣品水溶液在 2°C 、pH 7 的環(huán)境下下能穩(wěn)定儲存156 天,其粒徑和siRNA包封率沒有明顯變化。Suzuki 等人的補充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 環(huán)境下穩(wěn)定儲存1.5。總之,這些數(shù)據(jù)都表明是mRNA 的不穩(wěn)定,而不是 LNP 的不穩(wěn)定,導(dǎo)致了當(dāng)前mRNA-LNP疫苗的儲存條件嚴苛和保質(zhì)期短。


Fan等人總結(jié)了脂質(zhì)體和 LNP的穩(wěn)定性及其質(zhì)量屬性。LNP 可以承受化學(xué)和物理不穩(wěn)定性,化學(xué)不穩(wěn)定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂質(zhì)的降解。脂質(zhì)氧化可能發(fā)生在不飽和脂肪酸部分(Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在該問題)和膽固醇,氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基團存在雜質(zhì)導(dǎo)致的結(jié)果。除此之外,氧化性雜質(zhì)也可能導(dǎo)致包封的mRNA 氧化。脂質(zhì)例如 DSPC 和可電離的陽離子脂質(zhì)中的羧酸酯鍵容易受溫度和pH依賴性的水解的影響(圖 6)。


LNP 穩(wěn)定性的另一個關(guān)鍵因素是物理穩(wěn)定性,主要有三種類型的物理不穩(wěn)定性:包封的藥物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在儲存和流通過程中容易發(fā)生 LNP 的聚集,所以為了增加穩(wěn)定性,LNP 中通常添加PEG化脂質(zhì),LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。


另一種類型的物理不穩(wěn)定性主要由于mRNA 的泄漏,這主要影響包封產(chǎn)品的穩(wěn)定性。值得注意的是,包封率通常 > 90%,并且尚未報道過在儲存期間出現(xiàn)mRNA泄露(用RiboGreen監(jiān)測)的情況。未包封的mRNA(“裸露的mRNA”)幾乎不會被細胞攝取;而且它會迅速被降解,因此無法用于翻譯。

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圖6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂質(zhì)。


由于注射 mRNA-LNP疫苗時的超敏反應(yīng)可能與PEG化脂質(zhì)有關(guān),因此,已經(jīng)研究了防止聚集體形成的替代脂質(zhì)。使用多聚肌氨酸修飾脂質(zhì)能使脂質(zhì)遞送系統(tǒng)更加穩(wěn)定,在防止LNP聚集的同時能夠減少超敏反應(yīng)。但是目前仍然需要更多的實驗來確定這種 PEG化脂質(zhì)替代品是否能真正的提高 mRNA 的穩(wěn)定性(例如不含過氧化物,注:目前使用的PEG脂質(zhì)由于工藝原因,會有一定的過氧化物雜質(zhì),這會引起LNP中其他含有不飽和鍵的脂質(zhì)和mRNA的氧化降解)。


分析 LNP 穩(wěn)定性


Fan 等人在前面提到的文章中對監(jiān)測 LNP 穩(wěn)定性的分析方法進行了專業(yè)評估。我們推薦感興趣的讀者可以查看相關(guān)文獻。


mRNA-LNP中哪個成分更不穩(wěn)定?


迄今為止,已有幾項研究考察了在儲存期間穩(wěn)定 mRNA 和穩(wěn)定 LNP 的方法。然而,兩者之中哪一個才是mRNA-LNP穩(wěn)定性的瓶頸?當(dāng)mRNA-LNP 制劑未冷凍時,是mRNA 降解?還是 LNP 降解導(dǎo)致穩(wěn)定性問題?還是 mRNA 與 LNP 的組合?


與mRNA-LNP 系統(tǒng)相比,包封化學(xué)修飾且高度穩(wěn)定的siRNA 分子(例如 Onpattro)的LNP系統(tǒng)具有更長的有效期。這表明當(dāng)前的穩(wěn)定性瓶頸不是 LNP,而是 mRNA。


迄今為止,公開資料還沒有披露關(guān)于 mRNA-LNP 制劑中 mRNA 和 LNP 完整性的研究報告。在研究存儲效果的少數(shù)研究中,例如 Zhang等人的研究,并沒有考察長期儲存的穩(wěn)定性。因此,我們將首先研究裸露的mRNA的長期穩(wěn)定性,但需要注意的是,這可能與包封在 LNP中的 mRNA 的穩(wěn)定性有所不同(見下文)。


在Pascolo等人的綜述中,裸露的mRNA的水溶液在無RNase的情況下只能在4°C下儲存幾天。這似乎符合目前對 mRNA 不穩(wěn)定性的看法。目前關(guān)于裸露的mRNA長期穩(wěn)定性的研究表明,mRNA 需要冷凍或干燥才能保持更長時間的穩(wěn)定。


Roesler等人2009年的研究表明,編碼熒光素酶的mRNA 在無RNA酶存在的條件下,分別以液體或凍干形式在室溫下儲存,表達效率分別在第8天和第16天開始出現(xiàn)降低,凍干輔料和凍干工藝方面未經(jīng)優(yōu)化(見圖 7)。同時本研究無法得出關(guān)于2-8℃溫度下長期儲存穩(wěn)定性的結(jié)論,因為穩(wěn)定性研究只考察了32 天。


Wayment-Steele等人經(jīng)過基于理論降解速率計算,預(yù)測 長度為4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的條件下,存儲的半衰期為 941 天。他們注意到較長的mRNA序列,例如SAM,更容易發(fā)生水解。由于這是jin基于水解降解動力學(xué)的理論計算結(jié)果,可能會低估 了mRNA的實際降解速率,例如,當(dāng)存在痕量RNase時,必須對 mRNA 的穩(wěn)定性進行更多研究才能知道m(xù)RNA實際存儲的穩(wěn)定性情況。

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圖7 通過轉(zhuǎn)染BHK-21細胞中熒光素酶表達效率分析mRNA在水中的穩(wěn)定性


這些研究表明,在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 穩(wěn)定。然而,應(yīng)該重申的是,這兩種成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果可能與LNP包封mRNA 的情況不同。如前幾節(jié)所述,mRNA 與可電離的陽離子脂質(zhì)、膽固醇和水一起位于 LNP 核內(nèi)部(參見圖 4)。這意味著 mRNA 處于水性環(huán)境中,因此容易發(fā)生水解,其水解的機制可能與溶液中 mRNA水解 的機制相似。然而,另一方面,LNP 內(nèi)的 mRNA 可能通過疏水、氫鍵和/或靜電相互作用被可電離的脂質(zhì)包裹。在這種情況下,mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更穩(wěn)定。在沒有進一步研究的情況下,只能得出結(jié)論,mRNA 的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了儲存條件苛刻。 


儲存條件不同的原因


當(dāng)前 mRNA 疫苗的另一個有趣方面是,不同廠家疫苗報告的儲存溫度和相應(yīng)的“有效期”差異很大:從 -80°C 到 2-8°C,從幾天到幾個月。是否因為mRNA 疫苗處的不同導(dǎo)致這種儲存條件的差異?又或者,儲存條件的差異是否與熱穩(wěn)定性測試結(jié)果相關(guān)或更可靠的方法有關(guān)?這些信息很重要,因為深入了解對穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響的因素可能是未來設(shè)計熱穩(wěn)定mRNA 疫苗的關(guān)鍵突破點。


Acuitas Therapeutics的首席執(zhí)行官Tom  Madden 曾經(jīng)在采訪中表示,Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的穩(wěn)定性。后者是否有可能使用更保守的方法來確保穩(wěn)定性?盡管如此,目前必須在 -60 至 -80 °C 之間儲存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的溫度和冷藏條件下進行了穩(wěn)定性考察,正如CureVac 科學(xué)家所做的那樣。


此外,穩(wěn)定性測試中的分析技術(shù)在靈敏度上可能不同,驗收標(biāo)準(zhǔn)也可能不同。疫苗穩(wěn)定性研究報告的發(fā)布可能對這些疑問作出回答,對此進行比較研究會是很有趣的工作。



文獻來源:

1. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H., 2006. Freeze-drying of

nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Adv. Drug Deliv.

Rev. 58 (15), 1688–1713. https://doi.org/10.1016/j.addr.2006.09.017.

2. Yanez Arteta, M., Kjellman, T., Bartesaghi, S., Wallin, S., Wu, X., Kvist, A.J.,

Dabkowska, A., Sz′ekely, N., Radulescu, A., Bergenholtz, J., Lindfors, L., 2018.

Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered

by functionalized lipid nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115 (15),

E3351–E3360. https://doi.org/10.1073/pnas.1720542115.

3. Ayat, N.R., Sun, Z., Sun, D.a., Yin, M., Hall, R.C., Vaidya, A.M., Liu, X., Schilb, A.L.,

Scheidt, J.H., Lu, Z.-R., 2019. Formulation of biocompatible targeted ECO/siRNA

nanoparticles with long-term stability for clinical translation of RNAi. Nucleic Acid

Ther. 29 (4), 195–207. https://doi.org/10.1089/nat.2019.0784.

4. Baden, L.R., El Sahly, H.M., Essink, B., Kotloff, K., Frey, S., Novak, R., Diemert, D.,

Spector, S.A., Rouphael, N., Creech, C.B., McGettigan, J., Khetan, S., Segall, N.,

Solis, J., Brosz, A., Fierro, C., Schwartz, H., Neuzil, K., Corey, L., Gilbert, P.,

Janes, H., Follmann, D., Marovich, M., Mascola, J., Polakowski, L., Ledgerwood, J.,

Graham, B.S., Bennett, H., Pajon, R., Knightly, C., Leav, B., Deng, W., Zhou, H.,

Han, S., Ivarsson, M., Miller, J., Zaks, T., 2021. Efficacy and safety of the mRNA-

1273 SARS-CoV-2 vaccine. N. Engl. J. Med. 384 (5), 403–416. https://doi.org/

10.1056/NEJMoa2035389.

5. Ball, R.L., Bajaj, P., Whitehead, K.A., 2016. Achieving long-term stability of lipid

nanoparticles: examining the effect of pH, temperature, and lyophilization. Int. J.

Nanomed. 12, 305–315. https://doi.org/10.2147/IJN.S123062.

6. Bloom, K., van den Berg, F., Arbuthnot, P., 2020. Self-amplifying RNA vaccines for

infectious diseases. Gene Ther. 1–13 https://doi.org/10.1038/s41434-020-00204-y.

Brader, M.L., Williams, S.J., Banks, J.M., Hui, W.H., Zhou, Z.H., Jin, L., 2021.

7. Encapsulation state of messenger RNA inside lipid nanoparticles. Biophys. J. https://

doi.org/10.1016/j.bpj.2021.03.012.

8. Brisco, M.J., Morley, A.A., 2012. Quantification of RNA integrity and its use for

measurement of transcript number. e144–e144 Nucleic Acids Res. 40. https://doi.

org/10.1093/nar/gks588.

9.Burke, P.A., Gindy, M.E., Mathre, D.J., Kumar, V., Prud’homme, R.K., 2013. Preparation

of Lipid Nanoparticles. US 2013/0037977.

10. Buschmann, M.D., Carrasco, M.J., Alishetty, S., Paige, M., Alameh, M.G., Weissman, D.,

2021. Nanomaterial delivery systems for mRNA vaccines. Vaccines 9 (1), 65. https://

doi.org/10.3390/vaccines9010065.






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